隨著先進(jìn)和微創(chuàng)外科技術(shù)的發(fā)展，手術(shù)中對病變組織的實(shí)時(shí)快速診斷成了一項(xiàng)困擾科研人員的難題。激光共聚焦顯微鏡（簡稱LSCM），因其高分辨率和深度層析成像的優(yōu)勢而受到關(guān)注，具有對活細(xì)胞和生物組織樣品進(jìn)行無損實(shí)時(shí)觀察的特點(diǎn)

本文旨在開發(fā)一種使用激光共聚焦顯微鏡對病變組織進(jìn)行快速診斷的方法。

K1-Fluo ABM 激光共聚焦顯微鏡的成像原理

K1-Fluo ABM是一款采用多通道激光熒光技術(shù)的共聚焦顯微鏡，與普通的熒光顯微鏡相比，有著更高的空間分辨率，*的三維成像方面有著明顯的優(yōu)勢。在細(xì)胞和組織切片的形態(tài)定位，立體結(jié)構(gòu)重組，觀察生化功能動(dòng)態(tài)變化過程方面有著*的優(yōu)勢。

K1－Fluo ABM配有(405nm. 488nm，561nm，638nm)四種不同波長的激光，在激光光源后面和檢測器的前面分別設(shè)置一個(gè)“針孔"兩者形成共軛關(guān)系，激光通過“照明針孔"后聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)被激發(fā)出來的熒光信號(hào)通過“探測針孔"后被電荷耦合元件（CCD）或光電倍增管（PMT）逐線或逐點(diǎn)接收轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，再通過計(jì)算機(jī)對電信號(hào)進(jìn)行處理最后轉(zhuǎn)換成圖像信號(hào)輸出。只有焦點(diǎn)處的光能沿著光路到達(dá)探測器，因此有效地降低了噪音，大大提高了圖像的質(zhì)量。

通過沿垂直方向移動(dòng)Z軸，可以獲得一張張光學(xué)切片，再通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對圖像進(jìn)行處理就可以獲得樣品的三維立體圖像。

K1－Fluo 的配置

K1-Fluo ABM 鏡身,　激光器、掃描器、控制器、PC和顯示器一整套系統(tǒng)。

K1-Fluo 的底部配置有一塊磁懸浮隔振板（Magnetic floating anti-vibration plate）可以有效的隔絕一些自然振動(dòng)，從而保證鏡身不受到外部震動(dòng)的干擾，獲得高質(zhì)量的圖像。與傳統(tǒng)笨重的空氣光學(xué)平臺(tái)不同，磁懸浮隔振板非常地輕便，放在普通的實(shí)驗(yàn)桌上就可以使用。而且K1-Fluo還可以根據(jù)使用者的需要增加DIC（微分干涉）和適用于LED激發(fā)熒光的濾波片，細(xì)胞孵化器等多種配件，兼容性非常強(qiáng)。

K1-Fluo ABM 在組織診斷中的應(yīng)用

一般情況下制備組織切片樣品需要以下的步驟：

(1)    Gross examination

(2)    Fixation

(3)    Washing

(4)    Dehydration

(5)    Cleaning

(6)    Impregnation or Infiltration

(7)    Embedding－Trimming

(8)    Microtome cutting

(9)    Stain

(10) Mounting.

由于該過程很長，因此不能用于手術(shù)期間的組織實(shí)時(shí)診斷。2019年由韓國高陽市國家癌癥中心，漢陽大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，韓國大田Nanoscope Systems,Inc ，韓國忠清北道Osong醫(yī)療創(chuàng)新基金會(huì)等聯(lián)合研究開發(fā)一種使用共聚焦顯微鏡檢查的簡單組織染色后不需要冷凍和切片的組織診斷方法。 該方法可作為適合在手術(shù)室使用的快速診斷一部分組織的方法。當(dāng)需要快速診斷組織時(shí)，可以使用最佳切割溫度（OCT）化合物在將組織切成薄片之前快速冷凍（Bancroft＆Gamble，2008年）。在癌癥手術(shù)中，獲得前哨淋巴結(jié)活檢結(jié)果對于確定所需的手術(shù)范圍至關(guān)重要。在諸如Mohs手術(shù)的皮膚癌手術(shù)中，為了正確考慮外觀和功能方面，在手術(shù)過程中需要進(jìn)行幾次冷凍切片活檢。這種類型的冷凍切片組織診斷需要大約15-40分鐘。但是，由于其影響，人們已集中精力減少這種時(shí)間。

最近引入了使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行術(shù)中診斷的方法，使用快速的 Hoechst 組織染色方法，我們在大約 2 分鐘的組織采集后可成功獲得組織圖像。我們發(fā)現(xiàn)，從動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)獲得的圖像可用于快速組織診斷，而無需組織切片。

(1)H&E 染色后光學(xué)顯微鏡下結(jié)腸正常黏膜的組織學(xué)圖像 (2) 在 Hoechst 33342 & Eosin 染色后，來自 K1-Fluo_RT 共聚焦顯微鏡的相同結(jié)腸正常粘膜的偽彩色圖像 (3) H&E染色后光學(xué)顯微鏡下胃癌組織學(xué)圖像 (4) Hoechst術(shù)后K1-Fluo_RT共聚焦顯微鏡下同一胃腫瘤的偽彩色圖像。 33342 & 曙紅染色 (5) H&E染色后光學(xué)顯微鏡下的乳腺癌組織學(xué)圖像 (6) Hoechst 33342 & Eosin 染色后 K1-Fluo_RT 共聚焦顯微鏡下同一乳腺癌的偽彩色圖像

在這項(xiàng)研究中，我們研究了選擇曙紅Y染料（Ex 488 nm / Em 499–633 nm）對蛋白質(zhì)染色，選擇Hoechst 33342（Ex 405 nm / Em 410–1313 nm）染色，該熒光染料具有不同的熒光波長選擇比曙紅Y染色的細(xì)胞核染色。使用便攜式共焦顯微鏡（K1-Fluo_RT，Nanoscope Systems，韓國）使用相應(yīng)的熒光信號(hào)捕獲共焦圖像。

K1-Fluo具有以下優(yōu)勢，首先通過采用各種熒光材料進(jìn)行染色，它可以用來同時(shí)識(shí)別組織中的各種結(jié)構(gòu)。 其次，使用熒光染料試劑綁定到抗體或類似化合物中，可以確認(rèn)組織中各種遺傳或蛋白質(zhì)的表達(dá)特征。第三，通過K1-Fluo熒光共聚焦顯微鏡可以獲得數(shù)字熒光圖像，從而進(jìn)行各種精確的數(shù)據(jù)處理和分析。最后，利用K1-Fluo的Z-STACK功能 可以獲取需要的薄組織的三維立體圖像，從而可以分析細(xì)胞組織的各種三維立體數(shù)據(jù)。

結(jié)論

雖然，熒光共聚焦顯微鏡在手術(shù)期間的實(shí)時(shí)診斷還未普及， 但是我們相信在不遠(yuǎn)未來K1-Fluo 有望成為微創(chuàng)外科手術(shù)行業(yè)有效的實(shí)時(shí)檢測設(shè)備

目前，韓國各生命工程學(xué)院，醫(yī)藥研究所已經(jīng)成為K1-Fluo 的忠實(shí)客戶。