激光熒光共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，可以利用可見(jiàn)光對(duì)熒光探針進(jìn)行激發(fā)，再利用計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)獲得細(xì)胞的圖像。激光熒光共聚焦顯微鏡不僅可以觀察固定的細(xì)胞、組織切片，還可以對(duì)活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察和檢測(cè)。

一.Z-STACK 三維構(gòu)建

激光熒光共聚焦顯微鏡采用的是類(lèi)似于連續(xù)斷層掃描的方法，即通過(guò)移動(dòng)Z軸獲得一張張連續(xù)的光學(xué)切片，通過(guò)計(jì)算機(jī)可以將這些光學(xué)切片重新組構(gòu)建成一張三維圖像（可做單色或多色圖像處理組合成細(xì)胞真實(shí)的三維結(jié)構(gòu)）。通過(guò)旋轉(zhuǎn)，可觀察細(xì)胞各個(gè)側(cè)面的表面形態(tài)，也可以從斷面觀察細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，測(cè)量細(xì)胞的長(zhǎng)寬高，體積，細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)等功能。通過(guò)shadow功能，可以去除細(xì)胞上的陰影，突出細(xì)胞的立體效果。LSCM的Z-STACK廣泛應(yīng)用于細(xì)胞骨架，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞器等的細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析中。

二. 細(xì)胞靜態(tài)結(jié)構(gòu)檢測(cè)，原位鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子觀察

1.檢測(cè)細(xì)胞凋亡

2.細(xì)胞原位檢測(cè)核酸

細(xì)胞核定位及其形態(tài)學(xué)觀察，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制及斷裂情況以及染色體定位觀察

3.細(xì)胞器觀察及測(cè)定

4.觀察細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)

5.檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂肪

6.檢測(cè)細(xì)胞融合

三.動(dòng)態(tài)觀察

1.實(shí)時(shí)定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣的變化

2.測(cè)定細(xì)胞內(nèi)PH的變化

激光共聚焦顯微鏡是測(cè)量若干種離子濃度并顯示其分布的有效工具，對(duì)焦點(diǎn)信息的有效辨別使在亞細(xì)胞水平顯示離子分布成為可能。利用熒光探針，可測(cè)量單個(gè)細(xì)胞內(nèi)PH和多種離子（Ca+，K+，Na+，Mg2+）在活細(xì)胞內(nèi)的濃度及變化。一般來(lái)說(shuō)，電生理記錄裝置加攝像技術(shù)可以快速檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)離子量變化，激光共聚焦技術(shù)可以提供更好的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中Ca+濃度的動(dòng)態(tài)變化圖像，對(duì)研究Ca+細(xì)胞內(nèi)動(dòng)力學(xué)有意義。

3.檢測(cè)膜電位的變化

JC-1 低電位下單體存在，發(fā)綠色的熒光，高電位下J-聚集體發(fā)紅色的熒光，隨電位增加，紅色熒光也增加。

4.檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生

5.藥物篩選

對(duì)藥物，病毒，細(xì)菌等進(jìn)行熒光標(biāo)記，當(dāng)檢測(cè)藥物跨膜進(jìn)入組織或細(xì)胞中時(shí)，可檢測(cè)藥物是否進(jìn)入，位置含量以及動(dòng)態(tài)過(guò)程。

6.細(xì)胞間的通訊研究

激光共聚焦顯微鏡可通過(guò)觀察細(xì)胞縫隙連接分子的轉(zhuǎn)移來(lái)測(cè)量傳遞細(xì)胞調(diào)控信息的一些離子，小分子物質(zhì)。該技術(shù)可以用于研究胚胎發(fā)育，生殖發(fā)育，神經(jīng)生物學(xué)，腫瘤發(fā)生等過(guò)程中縫隙連接通訊的基本機(jī)制和作用，也可以用于鑒別對(duì)縫隙連接作用有潛在毒性的化學(xué)物質(zhì)。

7.觀察細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)

LSCM已經(jīng)極大地提高了光子產(chǎn)生效率，樣品可以與更小毒性的染料結(jié)合減少每次掃描時(shí)激光束對(duì)細(xì)胞的損傷，可用于數(shù)小時(shí)的長(zhǎng)時(shí)程定時(shí)掃描，記錄細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)等細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象。

8.檢測(cè)熒光漂白的恢復(fù)

當(dāng)一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的熒光分子被激光漂白或淬滅失去發(fā)光能力，臨近細(xì)胞中未被淬滅的熒光分子可以通過(guò)細(xì)胞間的縫隙擴(kuò)散到已經(jīng)被漂白的細(xì)胞中，從而恢復(fù)熒光。該技術(shù)可用于分析分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸，受體在細(xì)胞膜上的流動(dòng)和大分子組裝等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。